DNA甲基化是基因表达调控的一种重要机制，DNA甲基化检测是指利用各种方法对肿瘤细胞DNA甲基化程度进行测定。在恶性肿瘤的发展中，甲基化的状态并不是一成不变，肿瘤细胞内全基因组的低甲基化程度与疾病进展、肿瘤大小和恶性程度都有密切的关系，DNA甲基化检测对肿瘤恶性程度的判断有重要意义。

DNA甲基化的检查前准备

1.向被检测者解释本操作的目的、方法等，消除顾虑。

2.选取血液、其他体液或细胞进行检测，如需要进行有创伤的操作则需要提前完善凝血功能测定等相关检查。

DNA甲基化的操作方法

1.基因组DNA的提取及浓度测定，设计引物时要求所扩增的片段中必须含有一个或一个以上的CpG岛，以保证检测可以正常进行。

2.基因组DNA进行化学修饰，主要采用亚硫酸氢钠修饰，注意温度和时间的掌握，修饰后的DNA单链比较脆弱，操作应轻柔，避免剧烈振荡。适当增加亚硫酸氢钠的浓度，同时适当减少基因组DNA的量可防止假阳性的出现。

3.以修饰后的基因组DNA为模板，分别用甲基化引物和非甲基化引物进行PCR扩增，可选用热启动酶或者采用降落PCR等方法提高PCR扩增的特异性。

4.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳以判断结果。

DNA甲基化的结果分析

在进行甲基化和非甲基化PCR扩增时，均设立空白对照和阳性对照。如果只扩增出非甲基化条带，判断为非甲基化；相反，如果只扩增出甲基化条带，则判断为甲基化；如果既能扩增出甲基化条带又能扩增出非甲基化条带，说明是半甲基化状态，在统计结果时也计为甲基化阳性。肿瘤细胞DNA总体甲基化的程度越低，癌症的恶性程度也就越大。

DNA甲基化检测方法

1、甲基化特异性PCR (MS-PCR) 

这种方法经济实惠，无需特殊仪器，目前应用最广。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后进行引物特异性的PCR。MS-PCR中需要设计2对引物，检测MSP扩增产物，根据处理后甲基化或非甲基化DNA链的引物能否扩增出片段判断被测位点是否存在甲基化 。

这种方法避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题，敏感性高。但需要预先知道待测片段DNA的序列，同时引物设计非常重要，若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂，可能出现假阳性。

2、荧光定量法(Methylight) 

Methylight技术是2000年由Eads等报道，其原理是使用荧光水解探针，在MSP扩增同时检测荧光强度，使得定量检测甲基化成为可能。

首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。

其优势在于高通量、高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，可以做到多样本、多基因位点的快速分析。但费用较高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。

3、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA) 

又称重亚硫酸盐甲基化PCR-SSCP(BiPS)，1999年由Maekawa等报道。由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定，因此，经处理后变性的单链DNA在电泳中移动速率不同，将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，从而判定待测片段中甲基化情况。

方法是先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳。

这种方法可应用于任何序列的甲基化状态分析，并能够对甲基化的等位基因进行半定量，但敏感性及准确性略低，检测片段不宜过长。

4、甲基化敏感性斑点分析（MS-DBA) 

2005年GClément等报道，能够定量或半定量分析样本中的甲基化水平。

这个方法的过程是：先用重亚硫酸盐处理待测DNA，随后以非CG区的引物行PCR扩增，将扩增产物变性后转移到尼龙膜上，用3'端DIG标记的含有2个CG(或TG)的双核苷酸探针与DNA杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交的标本含有甲基化，而与TG探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。

这种方法虽然快速、简便、易于掌握，也可一次检测多种样本，但检测序列不能过长，可能出现假阳性或假阴性结果。

DNA甲基化检测标准举例

1、GB/T 40183-2021 DNA甲基化的测定 焦磷酸测序法

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