固氮酶活性检测实验室

固氮酶是一种能够将氮分子还原成氨的酶。固氮酶是由两种蛋白质组成的：一种含有铁，叫做铁蛋白，另一种含铁和钼mo3+，称为钼铁蛋白。钼铁蛋白中含有7个铁，9个硫，1个钼，1个中心碳。

固氮酶结构

1、Fe蛋白

Fe蛋白由nifH基因编码。对多种生物固氮酶铁蛋白的一级结构的测定结果表明，Fe蛋白都不含色氨酸，酸性氨基酸的含量均高于碱性氨基酸，各属种间的同源性为45%～90%，说明铁蛋白的基本结构较为保守。

Fe蛋白是两个相同的亚基组成的γ2型二聚体。二聚体的分子量约为59～73kD(因菌种不同而差异)，每个亚基的分子量约30kD。两个亚基通过一个[4Fe-4S]金属簇桥连，每个亚基的核心是一个由8个β折叠片形成的平面，侧面与9条α螺旋相连。在二聚体两个亚基的界面之间还存在大量的氢键和静电作用。这些作用力很强，即使[4Fe-4S]簇被抽提，铁蛋白二聚体的结构仍能保持。

2、MoFe蛋白

Kennedy等人通过SDS-PAGE法，发现钼铁蛋白含有两种亚基，已经确定其为异四聚体(α2β2)，分子量约220k～240kD之间(因不同来源而异)。α亚基分子量为55kD，由nifD基因编码，大小约为500个氨基酸，氨基酸序列的同源性在47%～66%，具有相当高的保守性。

在已知的α亚基氨基酸序列中，有5个Cys残基(Cys62、Cys88、Cys154、Cys183、Cys275)是绝 对保守的，可能和钼铁蛋白中金属原子簇的生物合成有关。nifK基因编码的β亚基分子量为60kD，氨基酸序列与α亚基比较相似。α亚基和β亚基之间存在广泛的相互作用，它们构成一个近似轴对称的αβ，两个αβ二聚体以近似轴对称的方式交联起来，形成了α2β2四聚体。

防氧保护机制

固氮菌在进化过程中，发展出多种机制来解决既需氧又防止氧对固氮酶的操作损伤的矛盾。

1、固氮菌以较强的呼吸作用迅速地将周围互不干涉中的氧消耗掉，使细胞周围处于低氧状态，保护固氮酶不受损伤。

2、在根瘤菌中，以豆血红蛋白与氧气结合的方式使豆血红蛋白周围的氧气维持在一个极低的水平。

3、有些固氮菌能形成一个阻止氧气通过的粘液层。

活性检测——乙炔还原法

1、取盆栽土样 1- 5 g 于 100 mL 血清瓶中，加入 0. 1 mol/L 葡萄糖液 2 mL，塞上异丁基胶塞摇匀，加铝盖密封。用注射器从瓶中抽出 5 mL 空气再注入等体积乙炔气体，密封针眼，28 ℃培养 2 d。培养结束后，取 500 μL 气样在气相色谱仪上测定乙烯峰值。

2、取0.1g-0.5g菌或0.5-1ml菌液 5于 100 mL 血清瓶中，加入 0. 1 mol/L 葡萄糖液 2 mL，塞上异丁基胶塞摇匀，加铝盖密封。用注射器从瓶中抽出 5 mL 空气再注入等体积乙炔气体，密封针眼，28 ℃培养 2 d。培养结束后，取 500 μL 气样在气相色谱仪上测定乙烯峰值。

检测标准

1、DB23/T 3169-2022 大豆根瘤菌竞争结瘤能力与固氮效果评价技术规程

2、NY 411-2000 固氮菌肥料

3、TCVN 6166-2002 微生物固氮肥

4、T/DGAS 004-2018 玉米固氮菌肥料

5、DB65/T 3323-2011 陆生固氮蓝藻固沙技术规程